本期AVT小編給大家?guī)硪黄梦姆窒?，來自《中國藥科大學學報》2020年第51卷第6期論文——用于新型冠狀病毒核酸檢測的即時檢測方法研究進展，感興趣的小伙伴快來看一下吧！

 文章作者：鮑瑤菲 1 薛茜茹 1 武海萍 2 鄒秉杰 2 宋沁馨 1 周國華 2,3

 本文亮點

 新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）已蔓延至全球，其傳染性強、潛伏期長，且存在無癥狀感染者，嚴重威脅人類的健康。在缺乏特xiao藥物并且疫苗尚未大面積使用的情況下，準確快速地甄別出 SARS-CoV-2 感染者, 并對其實施隔離是目前疫情防控的最有效手段。核酸檢測在此次疫情防控中起到了至關重要的作用，尤其對于無癥狀感染者的確診和康復期患者的出院評判，SARS-CoV-2核酸檢測成為了主要標準。但是基于實驗室的標準化核酸檢測方法周轉時間長、成本高，因此急需開發(fā)便捷檢測新冠病毒的方法，實現(xiàn)在資源有限的情況下快速測試并及時控制疫情。本文主要從提取、核酸擴增、檢測和商業(yè)一體化即時檢測方法四個方面總結了目前已有的針對新冠病毒開發(fā)的核酸即時檢測方法（point-ofcare testing，POCT）及其原理。宋沁馨教授課題組也正在開發(fā)基于核酸侵入反應技術和納米金可視化檢測原理的新冠病毒快速檢測新方法，以期能夠為檢測能力不足及資源匱乏地區(qū)新冠核酸即時篩查提供參考。合理利用即時檢測可以分擔標準實驗室的負擔，提高各國對疫情快速篩查、及時防控的能力，為SARS-CoV-2及其他新興傳染病的緊急應對和快速部署提供參考。

【摘要】

 新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在全世界范圍內快速傳播，截至2020年9月30日全球感染人數(shù)已達3 300萬人，造成100多萬人死亡，給公眾的生命健康造成嚴重威脅?；趯嶒炇业臉藴驶怂釞z測方法周轉時間長、成本高，因此急需開發(fā)便捷檢測新冠病毒的方法，實現(xiàn)在資源有限的情況下快速測試以及時控制疫情。本文從提取、擴增、檢測3個方面總結了針對新型冠狀病毒所開發(fā)的核酸即時檢測方法（point-of-care testing，POCT），并對整合了這3個步驟的商業(yè)化即時檢測裝置進行簡要介紹，以期為COVID-19及其他新興傳染病的緊急應對和快速部署提供參考。

 【關鍵詞】新型冠狀病毒; 核酸檢測; 即時檢測; 進展

 自新型冠狀病毒首ci出現(xiàn)以來，在全世界范圍內快速傳播，現(xiàn)已至全球大流行，截至2020年9月30日全球感染人數(shù)已達3 300萬人，造成100多萬人死亡，且確診人數(shù)和死亡人數(shù)還在持續(xù)增加，給全球經濟和公眾健康都造成了嚴重的威脅。國際病毒分類委員會將這種新的冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2），SARS-CoV-2是一種單鏈正股RNA病毒，目前用于檢測SARS-CoV-2的基因靶標有核衣殼（N）、包膜（E）、刺突（S）、RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）和開放閱讀框架1ab（ORF1ab）基因等。

 基于核酸的檢測方法具有高靈敏度和低假陰性率的優(yōu)勢，相對其他檢測方法（如抗體檢測）更靈敏、特異性更好，目前各國檢測新冠病毒最普遍方法為對口咽或鼻咽拭子進行基于實驗室的病毒RNA的逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-PCR，RT-PCR），這已成為用于確診新冠感染的金標準，被中國國jia衛(wèi)建委、WHO等作為新冠確診的重要依據(jù)。但這種方式普遍檢測時間長（約1.5~ 2 h），需要昂貴的大型儀器、專門的試劑、專業(yè)的操作人員以及在完備的符合生物安全條件的標準實驗室中才能進行，并不適合及時檢測，這就導致無法在第一時間對疑似病例進行及時快速的檢測，遲滯疫情防控工作的進行，對公共安全造成潛在影響。因此急需能夠在資源有限的情況下實現(xiàn)快速便捷檢測新冠病毒的方法以及時控制疫情，即時檢測（point-of-care testing，POCT）又稱床旁檢測就成為了對標準實驗室檢測流程很好的補充，它是指在采樣現(xiàn)場進行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到結果的一種檢測方式。即時檢測不僅適用于臨床實驗室，還可以由受過簡單訓練的非實驗室人員在樣品采集現(xiàn)場（例如床旁，醫(yī)生辦公室或急診室）中進行。此外，即時檢測只需要很少的操作步驟，通常無需培訓或只需要進行簡單培訓即可熟練掌握，結果易于讀取，具有準確、快速、便攜、簡便和低成本的優(yōu)勢，有利于更快的臨床決策并從專業(yè)檢測實驗室分擔工作負荷，加快篩查速度、控制疫情。

 本文主要從提取、核酸擴增、檢測和商業(yè)一體化即時檢測方法4個方面總結了目前已有的針對新冠病毒開發(fā)的即時檢測方法及其原理，以期為檢測能力不足及資源匱乏地區(qū)新冠核酸即時篩查提供參考，合理利用即時檢測可以分擔標準實驗室的負擔，提高各國對疫情快速篩查、及時防控的能力。

 1 樣本提取

 新冠檢測可用的樣本類型包括肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、痰液樣本等，其中最常用為鼻咽拭子，但鼻咽拭子的采集需要專業(yè)醫(yī)護人員按照標準的操作規(guī)范操作，采集過程中受試者會有不適感且對于醫(yī)護人員來說有暴露風險。因此選擇一種采集更便捷的樣本類型將更適合即時檢測。早先已有研究發(fā)現(xiàn)在唾液中可以檢出新冠病毒，唾液樣品收集快速、無創(chuàng)，價格低廉并且易于存儲，還可以避免收集鼻咽拭子樣本的風險，對患者和醫(yī)療保健提供者而言更加安全，并且唾液樣本采集方便不需要熟練的技術人員，適合非實驗室環(huán)境甚至居家檢測。Lamb等設計針對開放閱讀框ORF1ab的NSP3編碼區(qū)的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP），在30~45 min內完成模擬患者唾液樣品中特異性檢測SARS-CoV-2，與RT-PCR陽性一致率為95％（N = 19/20）。SalivaDirect方法也采用唾液作為檢測樣本，將核酸提取步驟替換成簡單的蛋白酶K和熱處理步驟，與基于鼻咽拭子純化提取的常規(guī)RT-PCR方法相比相關性達94％，且該檢測流程能與多種RT-PCR試劑盒兼容，極大縮短了檢測時間。

 此外，RUCDR Infinite Biologics開發(fā)的新唾液收集方法將比目前的鼻咽拭子方法更適合進行廣fan的人群篩查，提供了一種方便的樣品收集方法來開發(fā)價格適宜的即時護理測試套件，F(xiàn)DA已為該方法授予了緊急使用授權（EUA）。唾液作為一種樣本收集方法，對COVID-19患者SARS-CoV-2的檢測具有良好的準確性，有替代鼻咽拭子用作SARS-CoV-2的即時檢測樣本的潛力，但唾液中病毒載量在癥狀出現(xiàn)的第1周zui高，隨后會隨時間下降，與鼻咽拭子相比靈敏度有所下降。

 目前手動RNA提取限制了新冠即時檢測的開發(fā)和應用，常規(guī)的RNA提取意味著更長的周轉時間，更多的人力、試劑的成本，以及處理臨床標本時交叉污染和生物安全的風險。為了優(yōu)化提取步驟，Zhao等利用基于帶有羧基涂層的聚氨基酯磁性納米顆粒（pcMNPs）在20 min內從多個樣品中進行病毒RNA提取，該方法將裂解和結合合并為一個步驟，并且pcMNPs-RNA復合物可以直接引入后續(xù)的RT-PCR反應中。

 除了新的提取方法外，免提取方法的開發(fā)也是一種解決思路。Wee等提出了一種稱為直接快速免提取PCR（DIRECT-PCR）的方法，使用抗抑制劑的酶和試劑來免除RNA提取步驟，可在 36 min內在市售便攜式PCR熱循環(huán)儀上完成快速直接PCR檢測，針對呼吸道樣品中的病毒核衣殼（N）基因每個反應zui低可檢測到6個拷貝，減少了實驗室人員的操作時間和生物安全風險且具有便攜性，可在分子生物學實驗室之外進行。在基于等溫擴增原理開發(fā)的方法中發(fā)現(xiàn)，病毒運輸介質可能包含一種或多種抑制劑，將鼻咽拭子直接置于病毒運輸介質中不進行RNA分離步驟直接進行RT-LAMP，會使RT-LAMP的有效性降低。Wei等開發(fā)了一種直接在鼻咽拭子后的病毒轉運介質上檢測的方法，無需事先提取RNA，敏感性為85％，可以兼容不同制造商的試劑探針。雖然病毒轉運介質仍會使檢測靈敏度有所降低，但可以簡化工作流程，縮短周轉時間，更適合即時檢測。此外，超高靈敏度的檢測方法也可無需進行額外的樣品處理或RNA純化。

 2 核酸擴增

 2.1　逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR)

 RT-PCR是目前檢測新冠病毒核酸最普遍的方法，利用該原理開發(fā)的試劑盒數(shù)量占比也是最多的。RT-PCR的原理為利用逆轉錄酶將RNA轉換為與其互補的cDNA，隨后cDNA的特定區(qū)域經過聚合酶鏈式反應（PCR）進行擴增，在體系中添加化學發(fā)光物質從而擴增在過程中或終點處讀取熒光信號以實現(xiàn)檢測。

 基于實驗室的RT-PCR應用于即時檢測的主要障礙包括：實時熒光檢測儀通常體積較大、操作復雜需要專業(yè)人員、周轉時間長等。這些在即時檢測上的局限性促使研究人員探索在保持常規(guī)RT-PCR的靈敏度和特異性的同時簡化和縮短流程的方法。在RT-PCR的樣品擴增階段，需要熱循環(huán)儀來實現(xiàn)溫度的程序變化，但熱循環(huán)儀成本較高，在資源缺乏地區(qū)難以大量配備。Arumugam等開發(fā)了一種水浴加熱儀器替代PCR循環(huán)儀，包含兩個水?。阂粋€用于變性，另一個用于逆轉錄，然后使用電機操作臂將PCR管穿梭在兩個水浴之間進行退火延伸步驟，這臺設備造價便宜，可實現(xiàn)96個樣本同時處理，若使用薄膜PCR反應管可在12 min內完成反應，與臺式PCR儀相比速度明顯提升，適合在欠發(fā)達地區(qū)應用。

 2.2　等溫擴增

 核酸等溫擴增無需進行熱循環(huán)步驟，可以在恒定溫度下快速進行核酸擴增，是RT-PCR最有潛力的替代方法，能實現(xiàn)與RT-PCR相似水平的病毒RNA檢測且更加適合應用于即時檢測。目前用于即時檢測的常用的等溫擴增技術有環(huán)介導的等溫擴增（LAMP）、重組酶聚合酶擴增（RPA）和Nicking酶輔助反應（NEAR）技術。

 2.2.1　逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）

 RT-LAMP原理見圖1，首先將SARS-CoV-2的RNA基因組逆轉錄為cDNA，再設計4個能與靶基因組上6個不同區(qū)域結合的特殊設計的引物，使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶替代熱變性生成單鏈模板，在四引物系統(tǒng)中，有兩個內部引物和兩個外部引物。正向內部引物的3′末端引發(fā)了初始DNA鏈的合成，隨后被正向外部引物引發(fā)的合成所取代。正向內部引物的5′末端的反向互補序列與置換的ssDNA鏈中的下游序列退火，形成一個環(huán)。然后在每個末端環(huán)上的ssDNA充當LAMP擴增循環(huán)的起始，使目標序列被指數(shù)擴增。LAMP具有很高的特異性和敏感性，操作簡單，在60~65 ℃的恒溫下不到1 h即可完成，避免了使用熱循環(huán)儀的麻煩，并且由于使用了更多的引物因此具有很高的特異性?？梢酝ㄟ^添加pH敏感染料比色法、濁度法或熒光染料法等進行可視化檢測。

圖1 環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）原理示意圖

 Yu等開發(fā)了名為iLACO的資源缺乏地區(qū)即時檢測方案，以ORF1ab的片段作為靶標，在65 ℃的水浴中溫育，每毫升1 000個拷貝的濃度可以在20 min的反應時間內得出結果，但還不足以進行低病毒載量樣本的靈敏篩查。為了實現(xiàn)更高的靈敏度和特異性，Yang等對不同靶標進行了考察，發(fā)現(xiàn)ORF1ab基因具有很高的特異性但靈敏度低，而N基因具有很高的靈敏度但特異性不足，同時檢測ORF1ab基因，E基因和N基因可以保證對SARS-CoV-2的敏感性和特異性。為了提高擴增效率和耐受性，Lu等開發(fā)了基于SARS-CoV-2的N基因的利用高保真DNA聚合酶的單步單管耐錯配擴增技術，可除去擴增過程中引物3′端的錯配堿基，具有極好的耐受性，檢測限為每個反應118.6個拷貝。該分析的檢測速度比一般LAMP反應更快，可在不到20 min得到結果。作為一種常見的反應平臺，微流控芯片具備將所有試劑存儲在芯片上的能力，能夠整合并簡化操作步驟，對于消除對大型設備的需求至關重要，將微流體設備與等溫擴增結合使用可以為大眾提供更方便、便宜、便攜的新冠檢測方法。以上這些LAMP方法用于即時檢測均需要熱板或水浴，Gonzalez等報告了一種3D打印孵育室的開發(fā)，將靶向N基因的比色 RT-LAMP反應與用于市售Eppendorf PCR管的3D打印孵育室相結合，可以允許十二管反應同時進行，3D打印孵育室可以大規(guī)模生產，為基于LAMP的即時檢測提供了一種高成本效益的反應平臺。

 LAMP方法靈敏度高、特異性好，具有恒溫反應的優(yōu)勢，無需使用熱循環(huán)儀進行溫度程序設置，更加有利于即時檢測方法的開發(fā)。然而，由于LAMP需在60~65 ℃下進行擴增，仍然需要水浴、熱板等外部設備提供恒定的溫度，不利于設備小型化便攜化，因此在常溫下進行等溫擴增的方法在即時擴增領域更有前景。

 2.2.2　逆轉錄重組酶聚合酶擴增（RPA）

 RPA也是一種核酸等溫擴增方法，相比于LAMP反應溫度更低，在常溫下就可以實現(xiàn)反應，無需外部加熱部件。RPA的原理見圖2，主要依賴于3種酶：能結合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物靶向模板DNA中的同源序列，通過鏈置換DNA聚合酶發(fā)生鏈置換反應并啟動DNA合成，對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA單鏈與SSB結合防止進一步替換以穩(wěn)定開放的雙鏈體結構。結果可以通過與exo探針結合進行實時熒光定量、也可以與nfo探針結合使用側流試紙條檢測或加入染料肉眼可視化檢測讀取，更適合應用于即時檢測。

 圖2 逆轉錄重組酶聚合酶擴增（RPA）原理示意圖

 Behrmann等開發(fā)了應用exo探針的單管RT-RPA方法，與RT-qPCR相比具有100％的診斷敏感性和特異性，檢測限為每個反應7.74個拷貝，對于高RNA濃度樣本，可在7 min內獲得結果，該測定方法是迄今為止SARS-CoV-2最快的基于核酸的檢測方法之一。Xia等提出同時靶向N和S基因的一管“樣品進結果出”方案，檢測限低至每微升0.2個拷貝。Tholoth等將RPA和LAMP相結合，構建了用于檢測COVID-19的兩階段等溫擴增，稱為COVID-19 Penn-RAMP，第一階段在管帽中與外部LAMP引物初步反應，通過RPA擴增所有靶標，第二階段試管離心或翻轉，混合RPA和LAMP體系，啟動高度特異性的LAMP反應，進一步組合其他4種RAMP引物，這種嵌套結構可以實現(xiàn)更高的靈敏度，并且對抑制劑有更好的耐受性。

 RPA方法靈敏度高，無需加熱部件在常溫下即可擴增，并且反應速度相較于LAMP更快，然而由于專利原因，相關試劑需要從指定公司購入，導致成本提高并且限制了該方法在即時檢測上的應用。

 2.2.3　切口酶擴增反應(nicking enzyme amplification reaction，NEAR）

 NEAR原理見圖3，反應由逆轉錄酶、切口酶和恒溫擴增DNA聚合酶驅動，DNA模板與引物雜交，延伸產物被下一個模板置換，置換產物互補鏈延伸形成切口酶識別位點，切口酶識別并切割雙鏈DNA中的一條鏈的特定短序列形成缺口，恒溫擴增的DNA聚合酶從引物的3′端延伸核苷酸繼續(xù)合成短序列，得到NEAR擴增雙鏈，通過切割、延伸循環(huán)不斷擴增靶標DNA模板，設計分子信標產生熒光信號用于定量。NEAR可達到指數(shù)速率擴增，該方法的優(yōu)勢在于速度和靈敏度，缺點在于短序列的設計存在高假陽性的可能。

 圖3 切口酶擴增反應(NEAR)原理示意圖

 3 檢測方法

 3.1　實時熒光檢測

 實時熒光檢測原理為在體系中添加化學發(fā)光物質從而擴增在過程中讀取熒光信號以實現(xiàn)定量。在RT-PCR常用的方法為嵌入熒光染料法和Taqman探針法。嵌入熒光染料法是指使用能與DNA擴增產物非特異性結合的熒光染料（例如SybrGreen），Taqman探針法是指設計包含5′熒光團和3′淬滅基團的短的寡核苷酸探針與DNA模板中的序列退火，Taq聚合酶通過其5′至3′核酸外切酶活性切割退火的探針上的熒光基團，使其發(fā)出熒光。測定擴增產物熒光信號達到熒光閾值時所經歷的擴增循環(huán)數(shù)（Ct）即可進行定量。RPA在常溫下就可以反應，其結果可以通過與exo探針結合進行實時熒光定量。Behrmann等引入內部淬火探針（exo-IQ）的概念，猝滅基團通過內部linker連接在兩個核苷酸之間，克服了exo探針對胸腺嘧啶距離的設計限制，該策略大大簡化了exo探針的設計。在標準化實驗室采用的實時熒光檢測需要體積較大的實時熒光檢測儀，檢測人員也需要經過專業(yè)訓練，因而專門為即時檢測開發(fā)的商業(yè)化檢測儀器對實時熒光檢測儀進行小型化處理，使其與樣本提取擴增整合并且使結果易于讀取，更適合即時檢測環(huán)境，但由于仍需專門的儀器，在成本及推廣應用方面存在限制。

 3.2　可視化檢測

 相比于熒光檢測需要專門的儀器進行信號讀取，可視化檢測只需肉眼觀察即可，使得結果的讀取簡單直觀，更適合即時檢測?？梢暬瘷z測包括添加pH敏感染料比色法、濁度法或熒光染料法等方法。

 可視化檢測常應用于等溫擴增，Park等設計針對Nsp、S和ORF8基因的引物對，應用無色結晶紫實現(xiàn)比色檢測，可在30 min內得出結果，特異性好，檢測限為每個反應100個拷貝。Yan等通過實時濁度監(jiān)測和熒光鈣黃綠素可視化，平均可在26.28 min中檢測到SARS-CoV-2。通過130個臨床樣本驗證，靈敏度和特異性均為100％。Yu等選擇了一種新型的核酸染料GeneFinder?以進一步增強熒光信號和靈敏度?？梢暬瘷z測可以使得等溫擴增進一步適應即時檢測的使用場景，減少操作人員的專業(yè)要求，也不需要專門的設備，但相比于熒光檢測，靈敏度會有所下降。而結合智能手機的成像和傳感平臺可以實現(xiàn)可視化結果的量化，相比于目視判定更加客觀，可以提高檢測準確度。并且使用智能手機應用程序可以快速診斷疾病，監(jiān)控個人或人群的健康狀況，并向云端上傳地理和人口數(shù)據(jù)用于流行病學分析。開發(fā)結合智能手機的設備有利于快速、準確地應對當前以及未來的傳染病爆發(fā)。

 3.3　側向流檢測

 基于紙張的側向流分析（LFA）成本低，易于制造且與即時檢測完全兼容，是居家檢測或資源貧乏地區(qū)檢測的富有潛力的工具。Xia等進一步提出一種更簡化的甚至可以在家中進行檢測的RT-RPA方法，設計了nfo-affinity探針系統(tǒng)以及用于RNA檢測的側向流動試紙條，可以目視檢測到zui低1 ag N基因RNA，考察發(fā)現(xiàn)該方法可以簡單地通過使用保溫杯來執(zhí)行。AuNPs合成便利，表面可以被數(shù)百種核酸修飾?？赏ㄟ^由AuNPs聚集引起的顏色變化進行比色測定，閉管的反應形式可以zui大程度地減少操作步驟并避免交叉污染。Moitra等用針對SARS-CoV-2 N基因的巰基修飾的反義寡核苷酸封閉的AuNPs以及RNaseH以實現(xiàn)在10 min內通過觀測沉淀來“裸眼”選擇性檢測SARS-CoV-2。但檢測限為0.18 ng/μL RNA，因此僅采用納米粒子不足以靈敏檢測病毒RNA，將其引入核酸擴增系統(tǒng)中可以增強SARS-CoV-2檢測的靈敏度和特異性，同時實現(xiàn)可視化側向流檢測。Zhu等結合了針對ORF1ab、N基因的RT-LAMP與基于納米顆粒的側向流生物傳感器的分析方法，檢測限每個反應可達12個拷貝，分析靈敏度和特異性均為100％。從樣品收集到得出結果，整個診斷測試可在1 h內完成。此外也有商業(yè)化儀器采用側向流技術作為檢測方法例如Accula（Mesa Biotech），避免了使用熒光探針和檢測器的需求。

 3.4　CRISPR/Cas檢測

 CRISPR/Cas系統(tǒng)是用于基因編輯的常用工具，有準確識別和切割特定序列的能力，而活化的Cas酶在特異性切割靶RNA的同時能夠非特異性地切割周圍環(huán)境中的RNA或DNA，可利用這一特性實現(xiàn)核酸檢測。

 3.4.1　SHERLOCK

 SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）的原理見圖4，將病毒RNA靶標逆轉錄為cDNA后通過等溫擴增技術進行擴增，擴增的產物被T7RNA聚合酶轉錄回RNA以此擴增靶RNA。Cas13a是一種非特異性RNase，識別并結合靶向擴增的RNA產物后被激活，對附近的非靶向RNA進行非特異性反式核酸內切酶切割即“附帶”切割，裂解ssRNA報告分子使其從淬滅劑中釋放出熒光染料，用于信號放大和核酸檢測，并允許熒光，比色，側向流動等讀出方法來快速檢測各種靶標。Zhang等發(fā)布了用于檢測SARS-CoV-2的SHERLOCK流程，靶向Orf1ab和S基因，RPA等溫擴增后Cas13切割，在商業(yè)化試紙條上讀取結果，3步檢測僅需約1 h，但只使用合成的RNA對新冠病毒CRISPR檢測的表現(xiàn)進行了評估，未用患者樣本進行檢測。Hou等在RNA提取步驟之后，用靶向Orf1ab的SHERLOCK方法得到近單拷貝的靈敏度及良好的特異性。在52個患者臨床樣本中驗證具有100％的臨床靈敏度，周轉時間僅需40 min，證明了其診斷潛力。

 圖4 SHERLOCK原理示意圖

 SHERLOCK是兩步反應：首先RT-RPA擴增再轉錄回RNA進行Cas13檢測，由于涉及兩個單獨的反應步驟，因此需要進行液體處理和開管，這不僅增加了復雜性，而且大大增加了樣品交叉污染的可能性，不適宜在良好控制的實驗室環(huán)境范圍外使用。為了使SHERLOCK能在即時檢測領域得到更廣Fan的應用，Joung等開發(fā)了在一鍋中進行SHERLOCK測試的方法，稱為STOPCovid（SHERLOCK Testing in One Pot），將LAMP與CRISPR介導的檢測步驟相結合，將經典的兩步SHERLOCK轉化為單步反應，不需要樣本提取，檢測限為100個拷貝，可在1 h內用商業(yè)側向流試紙條或熒光讀數(shù)檢測，并通過臨床樣本進行了驗證，適用于即時檢測。

 3.4.2　DETECTR

 Cas12是CRISPR-Cas效應子家族的另一個成員，具有靶標激活的非特異性單鏈脫氧核糖核酸酶（ssDNase）特性，是一種RNA引導的DNA核酸內切酶，在結合靶序列后會不加區(qū)別地裂解ssDNA。在DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）方法中（圖5），病毒RNA首先被轉化為DNA，然后等溫擴增后的DNA中的特定靶序列激活Cas12a，Cas12a依次切割ssDNA報告探針釋放肉眼可見的熒光分子，可實現(xiàn)靈敏且特異的DNA檢測。

 圖5 DETECTR檢測原理示意圖

 基于熒光的檢測方法相對靈敏度更高且可以實現(xiàn)高通量檢測，Huang等采用一步式RT-RPA方法從鼻拭子提取的病毒RNA中擴增靶區(qū)域，并將所得的擴增產物整體轉移至96孔微量滴定板中進行熒光檢測，使用熒光板讀取器進行信號讀取，易于實現(xiàn)自動化，樣品到結果的時間約為50 min，檢測限為每個反應2個拷貝，靈敏度優(yōu)于qPCR測定法。該方法可以應用于大多數(shù)設備齊全的臨床實驗室中，但是需要進一步設計適當?shù)脑O備應用于即時檢測，以使資源缺乏的小型診所也能進行該測試。CRISPR還可以使用側向流試紙條來檢測信號，它不需要任何設備即可快速讀取結果，更適合應用于非實驗室環(huán)境中的即時檢測，對于單樣本測試，這是一個很好的解決方案，具有便攜低成本的優(yōu)勢，但使用側向流試紙條檢測結果的方法靈敏度會有所降低。以上開發(fā)的方法仍需對樣本進行開管進行液體操作，為了解決這一問題，Ding等提出All-In-One Dual CRISPR-Cas12（AIOD-CRISPR）檢測方法，用于核酸擴增和CRISPR檢測的所有成分都在一個單管反應系統(tǒng)中，靈敏度能達到每微升4.6個拷貝。而Guo等建立了一個集成樣品處理方案、重組酶輔助擴增（RAA）及CRISPR檢測的病毒核酸檢測平臺，檢測限為每毫升1×10 4拷貝，為了使該平臺更適合即時檢測，還構建了一個帶有藍色LED的便攜式暗盒以便實現(xiàn)可視化。

 基于RNA的CRISPR/Cas策略與等溫擴增結合的快速核酸檢測技術，可以提高等溫擴增測定的靈敏度，特異性和可靠性，CRISPR檢測還可與側向流讀數(shù)耦合，很適合居家檢測的場景，為下一代分子診斷技術的發(fā)展和即時檢測的應用展示了廣闊的前景。

 4 商業(yè)一體化即時檢測方法

 商業(yè)化即時檢測方法通常通過開發(fā)配套儀器設備來實現(xiàn)整合提取、擴增及檢測過程，將所有試劑裝在一個盒中，并通過使用機械操作或微流控技術以基本實現(xiàn)自動化、zui大程度地減少人工操作，減少總測試時間，提高周轉速度。

從2020年3月開始，美國食品和藥物管理局（FDA）對多項測試授予了EUA，值得注意的是有越來越多基于RT-PCR原理的即時檢測商業(yè)化測試正在被開發(fā)。目前獲得臨床實驗室改進修正案的質量標準（CLIA）豁免的基于RT-PCR原理進行SARS-CoV-2測試的即時檢測有Cepheid公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2和Mesa Biotech公司 Accula SARS-CoV-2。Xpert Xpress SARS-CoV-2（Cepheid）通過RT-PCR檢測E基因和N2基因兩個靶標，在大約45 min內即可得到結果，將整個過程自動化，不需要用戶進行特殊培訓。許多研究團隊將Xpert Xpress SARS-CoV-2與基于實驗室的RT-PCR在臨床樣本中進行了比較，顯示出極好的一致性（>99％），并且發(fā)現(xiàn)在較低的病毒水平也能可靠檢測。Mesa Biotech公司的Accula結合了RT-PCR分子診斷和側向流分析技術，僅需30 min即得到結果并且儀器僅手掌大小便于攜帶。為了評估Accula測試的性能，Hogan等比較了100份鼻咽拭子樣品的結果，總體一致性為84.0％，陽性一致性僅有68.0％。對于病毒載量低的樣品，陽性一致性較低，易出現(xiàn)假陰性。這表明Accula 即時檢測靈敏度不高，應仔細考慮即時檢測的潛在優(yōu)勢與降低診斷準確性之間的平衡。國內基于RT-PCR原理的商業(yè)化即時檢測裝置有圣湘生物科技股份有限公司的iPonatic移動分子診斷系統(tǒng)、上海透景生命科技股份有限公司2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（卡式熒光PCR法）。iPonatic采用一步核酸免提取技術，并搭配快速核酸檢測系統(tǒng)，一站式完成樣本裂解、核酸提取、PCR擴增及結果分析。透景生命的檢測卡盒采用磁珠法進行核酸提取，實現(xiàn)提取擴增全程自動化，但該方法需要手動裝載磁珠和樣本，需要在標準實驗室環(huán)境下進行。此外還有能夠實現(xiàn)多重PCR（mPCR）的商業(yè)化平臺，例如QIAstat-Dx（QIAGEN公司）、BioFire FilmArray（bioMérieux公司）等平臺。QIAstat-Dx除了支持液體運輸介質外，還有獨特的干拭子直接上樣程序，手動操作少于1 min，可在1 h內得出結果。BioFire FilmArray（bioMérieux公司）利用巢式多重PCR結合微流控芯片技術實現(xiàn)1 h快速檢測，巢式PCR技術可以zui大程度排除其他非特異性病原體核酸物質的干擾，同時提高了檢測靈敏度。表1列舉了目前商業(yè)化的基于RT-PCR原理的即時檢測方法。

 等溫擴增由于不需要借助熱循環(huán)儀，在恒定溫度下即可實現(xiàn)擴增和可視化檢測，因而可以大大減小設備體積，相對于RT-PCR更適合用于資源缺乏地區(qū)即時檢測的開發(fā)。北京航空航天大學、華西醫(yī)院聯(lián)合研發(fā)出一款針對ORF/N/E 3個基因位點的便捷式病原體核酸快速檢測儀，由便攜式檢測儀和等溫擴增檢測錐形微孔陣列高通量芯片構成，能實現(xiàn)高靈敏度、低成本（1萬元/臺，10元/人份）、快速（25 min）、高通量（64個）即時檢測，113例核酸樣本檢測表明靈敏度大于95%，特異性大于95.3%。優(yōu)思達公司EasyNAT即時分子診斷系統(tǒng)是已獲批的一體化等溫擴增儀器，試劑用玻璃化技術預混裝在全自動反應管中，將裂解、磁珠提取、純化、洗脫、擴增等過程在外部磁導的作用下自動化完成，整個過程耗時79 min，全程密閉檢測，無需專業(yè)PCR實驗室。Abbott公司的ID Now是利用NEAR原理的一種商業(yè)化即時檢測方法，它設計靶向擴增SARS-CoV-2的RdRp片段，可在5 min內提供0.125 copies/μL的靈敏度。檢測陽性樣品僅需5 min，陰性樣品也只需13 min。用熒光標記的分子信標特異性鑒定擴增的RNA靶標。然而，有評估顯示ID NOW與RT-PCR陽性一致率僅有約80％，這意味著Abbott公司的ID Now的性能有很大的局限性，對于強陽性和中等陽性樣品，ID NOW表現(xiàn)良好，但對于弱陽性樣品靈敏度降低，因此在對疑似患者使用此測試時，應考慮到靈敏度的問題。等溫擴增一體化儀器適合資源缺乏地區(qū)以及人流聚集環(huán)境下的便攜式病原體快速檢測，但目前對于低成本、高準確度、適合即時檢測的等溫核酸擴增儀的開發(fā)仍處于探索階段，有廣闊的發(fā)展前景。

 表1 目前商業(yè)化的基于RT-PCR原理的即時檢測方法

 5 總結和展望

 相比于基于實驗室的標準RT-PCR流程，即時檢測方法能夠在較短的時間內實現(xiàn)“樣本進，結果出”，可以促進更快的臨床決策，以社區(qū)為單位進行即時檢測可以減輕中心醫(yī)院和實驗室的負擔。目前已開發(fā)出許多為了更好地應用于新冠即時檢測而在提取、擴增、檢測等方面進行相應改進的方法，包括簡化提取步驟，優(yōu)化即時檢測場景下基于RT-PCR、核酸等溫擴增等原理開發(fā)的方法（表2）的擴增性能、采用熒光讀取、可視化技術、側向流檢測和CRISPR檢測以方便結果識別讀出等，推動實現(xiàn)準確，快速，便攜，簡便和低成本的即時檢測目標。但目前針對新冠檢測的即時檢測方法大多為概念研究階段，距離商品化應用還有距離。而已被批準上市的即時檢測方法需要在專門的配套儀器上使用，實現(xiàn)了提取、擴增、檢測一體化，極大推動了即時檢測的發(fā)展，但大多仍然需要專業(yè)人員在實驗室環(huán)境操作，且儀器價格較高、市場占有率小等問題也會限制其在即時檢測場景中的應用，此外部分商品化儀器實際檢測性能仍有待進一步評估和改進，市場上仍缺少真正能夠實現(xiàn)普通大眾居家或資源缺乏地區(qū)在非實驗室環(huán)境進行測試的準確可靠的即時檢測試劑盒，對于在受控環(huán)境之外和非專業(yè)訓練的工作人員進行測試時的污染和假陽性風險也是即時檢測所面臨的問題。即時檢測方法的開發(fā)主要是為了應用于資源短缺地區(qū)或待檢樣品數(shù)超過當?shù)貦z測能力地區(qū)的現(xiàn)場即時檢測，這就要求理想的研發(fā)方法能夠具有以下特征：（1）裝置盡量小型化、便攜化；（2）用戶友好，操作簡單，方便非專業(yè)操作人員的培訓；（3）考慮到生物安全問題，盡量設計為免提取密閉自動化操作，減少開蓋，保證非專業(yè)人員在非實驗室環(huán)境操作的安全；（4）周轉時間短，能在1~2 h或更短時間內出結果；（5）信號讀取方便直觀，可以直接得出是否為陽性的結果，例如可視化技術。除了為快速控制新冠病毒的傳播提供有力支持以外，這些針對新型冠狀病毒的即時檢測研究成果也可以應用于其他疾病的緊急防御和快速部署，有助于應對未來可能的新興傳染病。

表2 基于不同原理的SARS-CoV-2核酸即時檢測方法對比

 引用文本

 鮑瑤菲,薛茜茹,武海萍,鄒秉杰,宋沁馨,周國華.用于新型冠狀病毒核酸檢測的即時檢測方法研究進展[J].中國藥科大學學報,2020,51(6):635-645.

 本文系《中國藥科大學學報》原創(chuàng)。版權屬于《中國藥科大學學報》。

 艾偉拓，不忘初心，堅持始終，專注為高端注射劑領域提供支持與服務。